テクニカルノート

シーケンシングプライマーの設計に関するヒント

プライマーがテンプレートにしっかりと結合していることを確認します。プライマーの結合が不十分だと、低質の結果につながる可能性があります。
最適なシーケンシングプライマーの特徴：
長さはおよそ18～24塩基
融点（Tm）は50～60度
GC含量はおよそ45～55%にする
3'末端はGまたはCにする
3'末端がテンプレートで補足されている

ヒント：プライマーを準備・使用する際には、「pmol/μl = µM」の法則を忘れないでください。

PCR産物の精製に関するヒント

PCR産物は、ゲル抽出 / 水への溶出、または酵素処理を介して精製する必要があります。PCR反応で複数の産物が生成される場合（バンドが複数存在する場合）、ゲル抽出を使用してください。
PCRバンドの数がひとつしかなく、AzentaにPCRクリーンアップ手順を依頼されたい場合は、「カスタム」サービスをご注文し、「特別リクエスト」の列で「PCRクリーンアップ」をお選びください。精製済みのPCR産物に必要とされるDNAを同じ量だけお送りください。また、PCR産物のゲル画像（各ウェルの充填量とラダーの容量 / 質量がはっきり記されているもの）も同封してください。

PCRクリーンアップをご希望の場合は、USB CorporationのExoSAP-ITキット（カタログ番号78200）を使用するよう推奨します。

DNAシーケンシング向けに最適なテンプレート濃度を特定する作業に関するヒント

プラスミドについては、10 ng/µlをテンプレートの長さ（kb）で乗算します。
最適なプラスミドの濃度 = 10 ng/µl x kb

例：4.5 kbのプラスミド（ベクター + インサート）をお持ちの場合、プラスミドのサイズ（kb）を10で乗算します。その結果、シーケンシングの最適な濃度は45 ng/µlとなります。10 µlのテンプレートが必要なため、450 ngのプラスミドを提出していただきます。

精製PCR産物については、2 ng/µlをテンプレートの長さ（kb）で乗算します。

最適なPCR産物の濃度 = 2 ng/µl x kb

例：700 bpのPCR産物をお持ちの場合、産物のサイズ（kb）を2で乗算します。その結果、シーケンシングの最適な濃度は1.4 ng/µlとなります。10 µlのテンプレートが必要なため、14 ngの精製PCR産物を提出していただきます。