MATRICES DE BACTÉRIES ET DE PHAGES

Depuis 1999, GENEWIZ a rationalisé le processus de séquençage de Sanger pour faciliter la recherche génomique. Notre service d'amplification par cercle roulant vous permet de séquencer les clones bactériens ou les échantillons de phages sans aucune préparation plasmidique. L'amplification par cercle roulant génère de l'ADN pour le séquençage par amorçage de matrices circulaires avec hexamères aléatoires. Les protocoles d'amplification par cercle roulant GENEWIZ peuvent traiter les projets de séquençage de toute taille et sont optimisés pour produire des lectures de haute qualité à partir de clones bactériens (colonies et stocks de glycérol) et d'échantillons de phages (plages ou surnageants). L'amplification est également très efficace lorsque de faibles quantités de matières premières ADN sont disponibles (p. ex. des plasmides à faible nombre de copies).

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Séquençage de bactéries et de phages par amplification par cercle roulant

L'amplification par cercle roulant a été identifiée dans les systèmes naturels comme un mécanisme de réplication de l'ADN fréquemment employé dans la propagation plasmidique et virale. Lorsque des hexamères aléatoires sont couplés à une ADN polymérase à déplacement de brin, de nombreuses copies de matrice concaténées sont générées sans thermocyclage (Dean et al., 2001). Les brins synthétisés sont déplacés en un seul cycle d'amplification par cercle roulant et sont disponibles pour des cycles de liaison d'amorce supplémentaires. L'amplification exponentielle est réalisable si la réaction d'amplification par cercle roulant contient des amorces complémentaires aux deux brins de la matrice.

Processus d'amplification par cercle roulant

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Après la lyse, les échantillons bactériens sont combinés avec les dNTP, le polymérase et les hexamères aléatoires. Les hexamères se fixent par annelage à la matrice circulaire et la réplication se produit sur de nombreux sites simultanément.
Le polymérase est utilisé en raison de sa stabilité, sa processivité et sa fidélité élevées. Il permet un déplacement prolongé des brins sur plusieurs cycles d'amplification.
Alors que les tout nouveaux brins synthétisés sont déplacés, une série d'événements d'amorçage facilite l'amplification exponentielle de la matrice.
Une fois le processus d'amplification par cercle roulant terminé, l'échantillon est prêt pour le séquençage de Sanger.

Veuillez noter que l'amplification par cercle roulant ajoute 24 heures supplémentaires aux délais de séquençage standard.  L'amplification par cercle roulant est recommandée pour les matrices circulaires inférieures à 15 kb en longueur.

Dean, Frank B. et al. “Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.” Genome Research 11.6 (2001) : 1095–1099.

CARACTÉRISTIQUES ET AVANTAGES

Économies de temps et d'argent (mise en culture et préparation d'ADN non nécessaires)
&Plus de 600 bases de lecture de qualité Phred20
Amorces universelles GENEWIZ gratuites
Conception du projet et consultation
Analyse utilisant les analyseurs d'ADN ABI Prism 3730xl
Délais d'exécution rapides
Système de commande et de récupération de données en ligne GENEWIZ disponible 24 h/24, 7 j/7
Résolution des problèmes personnalisée

APPLICATIONS

Clonage de petits ARN en épingle à cheveux et criblage de banques : éliminez les préparations plasmidiques et séquencez directement les colonies.

Analyse de la méthylation de l'ADN : gagnez du temps et obtenez des lectures de haute qualité en clonant directement les produits d'ACP et en séquençant les colonies bactériennes.

Validation de banques d'anticorps à exposition sur phage : séquençage direct de phages pour accélérer le criblage et la validation.

OPTIONS D'ENVOI D'ÉCHANTILLONS

Options d'envoi d'échantillons

Stock de glycérol* Envoyez des tubes de 1,5 ml ou des plaques à 96 cupules ; les échantillons doivent être fournis sur de la neige carbonique. Veuillez étiqueter chaque type de produit.
Colonies bactériennes* Présentez les colonies dans une grille sur la plaque de gélose et entourez les colonies nécessitant un séquençage. Étiquetez numériquement chaque colonie. Notez que les plaques non numérotées seront traitées de façon aléatoire. Si vous utilisez une culture liquide, envoyez les échantillons sur une plaque à 96 cupules avec des barrettes de bouchons. Pour le transport, enveloppez les plaques de gélose dans du Parafilm et fournissez un coussinet de protection.
Surnageant de lyse** Veuillez envoyer 50 ul de surnageant de lyse dans des barrettes de 8 tubes d'ACP ou des tubes de 1,5 ml bien étiquetés avec le nom de l'échantillon.
Plage de lyse Entourez et numérotez les plages que vous envoyez pour le séquençage. Pour le transport, enveloppez les plaques de gélose dans du Parafilm et fournissez un coussinet de protection.

*Veuillez noter que les vecteurs d'expression peuvent être adaptés ou pas au protocole d'amplification par cercle roulant.

**Veuillez noter que l'amplification par cercle roulant est disponible pour le phage circulaire uniquement ; les génomes à phage linéaire ne seront pas amplifiés avec cette méthode.

Pour plus d'informations sur les matrices de bactéries et de phages, veuillez consulter notre page Recommandations relatives à l'envoi d'échantillons .


MODALITÉS DE COMMANDE

*Les échantillons doivent arriver au laboratoire de GENEWIZ au New Jersey avant 10:00 (HNE) pour remplir les conditions du service le jour même.Veuillez noter que les matrices de séquençage direct ne sont pas disponibles pour notre service le jour même.



E-mail | Téléphone (1-877-GENEWIZ (436-3949), poste 2) | Discussion en ligne

115 Corporate Boulevard, South Plainfield, NJ 07080 | +1-908-222-0711 | +1-908-333-4511

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